Resumen:
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Leishmania infantum (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) es el agente causal de la leishmaniosis visceral en la cuenca mediterránea, donde el perro es el reservorio principal. La infección se transmite al hospedador mamífero por la picadura de dípteros de la subfamilia Phlebotominae. El ciclo biológico del parásito es digenético, y en él se alterna un estadío extracelular móvil o promastigote, que se desarrolla en el hospedador invertebrado a su forma intracelular o amastigote, que se multiplica en el interior de fagocitos del hospedador mamífero. La secuenciación de los genomas de las principales especies de Leishmania, publicada entre 2005 y 2007, y el desarrollo de técnicas de alto rendimiento como los microarrays de ADN, la proteómica cuantitativa y más recientemente, las metodologías basadas en la secuenciación masiva, han permitido llevar a cabo un análisis exhaustivo de los perfiles de expresión génica del parásito a lo largo de su ciclo biológico, con el fin de hallar posibles factores de virulencia implicados en su patogenicidad y/o posibles dianas terapéuticas y candidatos vacunales. En un estudio de transcriptómica comparativa llevado a cabo en el laboratorio de Parasitología Molecular del Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC) se describió que los genes LinJ.34.0840 y LinJ.15.0240, que codifican proteína-fosfatasas 1 (PP1), están diferencialmente expresados en promastigotes de L. infantum extraídos directamente del tubo digestivo del vector Phlebotomus perniciosus. Aún habiéndose puesto de manifiesto en diversos estudios la importancia del estado de fosforilación proteico, durante los procesos de diferenciación del parásito, la funcionalidad concreta de las PP1 en Leishmania spp. es desconocida, al igual que las vías de señalización intracelular. Por este motivo, se decidió llevar a cabo la caracterización de estas proteínas en el desarrollo de esta tesis doctoral, realizada en dicho laboratorio. Aproximadamente un tercio de las proteínas de los organismos eucariotas se regulan por fosforilación. Las proteína-fosfatasas son las enzimas responsables de eliminar los ésteres de fosfato de estas proteínas. De acuerdo a su especificidad de sustrato las proteína-fosfatasas se pueden clasificar en dos sub-grupos: tirosina-fosfatasas (PTP) y serina/treonina-fosfatasas (STP). Las PP1 son STP y constituyen la familia más importante de proteína-fosfatasas en términos de diversidad de sustrato. Cada holoenzima de PP1 está compuesta por una subunidad catalítica y una subunidad reguladora. La subunidad catalítica de las PP1 representa una de las proteínas más conservadas en los organismos eucariotas, con una identidad de secuencia aproximada del 70% y un tamaño molecular comprendido entre 35 y 38 kDa. Las PP1 actúan de una manera muy específica y estrictamente regulada, dada su capacidad para formar complejos con un gran número de subunidades que controlan su localización, actividad y especificidad de sustrato. En los organismos vertebrados se han identificado cerca de 200 subunidades reguladoras o proteínas de interacción con PP1 (PIP). Estos complejos dan lugar a un conjunto diverso de holoenzimas con actividad dirigida a distintos sustratos y mecanismos de regulación propios. Esto explica la diversidad de funciones en las que participan las PP1: transcripción génica, ciclo celular, traducción, metabolismo, organización del citoesqueleto, regulación de transportadores, etc. El objetivo fundamental de esta tesis doctoral es la caracterización de la PP1 codificada por el gen LinJ.15.0240 (PP1-240) y del cluster de PP1 localizado en el cromosoma 34 (LinJ.34.0820, LinJ.34.0830, LinJ.34.0840, LinJ.34.0850) de L. infantum (cluster PP1C-34). Dicha caracterización incluye el estudio de la estructura primaria, el análisis de la expresión génica en los diferentes estadíos del ciclo biológico del parásito, el estudio de la localización subcelular y el estudio de las alteraciones en la expresión génica diferencial en líneas de promastigotes axénicos knock-in, es decir, transfectantes estables que sobre-expresan de forma constitutiva PP1-240 o el cluster PP1-34...
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