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Resumen:
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El patógeno de rumiantes Listeria ivanovii se diferencia de Listeria monocytogenes en que produce una fuerte hemolisis bizonal y una característica reacción de hemolisis cooperativa (tipo CAMP) en forma de pala con Rhodococcus equi. Hemos clonado el gen responsable de las propiedades hemolíticas diferenciales de L.ivanovii,smcL, que codifica una Smasa C similar (>50% de identidad) a las esfingomielinasas C de Staphylococcus aureus (B-toxina), Bacillus cereus y Leptospira interrogans. smcL se transcribe de forma monocistrónica y su expresión es independiente de PrfA. Southern blots de baja especificidad han demostrado que, dentro del genero Listeria, smcL esta presente solamente en L.ivanovii. Hemos construido un mutante nuloen smcL. Su fenotipo en agar sangre de oveja es idéntico al de L.monocytogenes (i.e. Debilmente hemolítico y sin reacción tipo CAMP con R.equi). Este mutante nulo en smcL. Su fenotipo en agar sangre de oveja es idéntico al de L.monocytogenes (i.e. Débilmente hemolítico y sin reacción tipo CAMP con R.equi). Este mutante es menos virulento en el modelo murino, y su capacidad de proliferacion intracelular en las celulas epitelioides bovinas MDBK esta disminuida. Se investigó el papel de SmcL en la supervivencia intracelular utilizando un mutante de L.monocytogenes que no poseía los determinantes membranolíticos hly, plcA y plcB que es, por tanto, incapaz de proliferar en el interior de las celulas. La complementación de este mutante con smcL en un plasmido fue suficiente para promover su multiplicación intracelular en las celulas MDBK . Mediante microscopia electrónica de trasmisión demostramos que SmcL contribuye a la disrupción de la vacuola fagocítica y el escape de la bacteria al citoplasma celular. Por tanto, L.ivanovii posee una tercera fosfolipasa membranoactiva que, conjuntamente con PlcA y PlcB, podría actuar en concierto con la toxina formadora de poros Hly para facilitar el escape de la bacteria del compartimento vacuolar. El extremo 5de smcL es contiguo al locus de internalinas i-inIEF, que también es especifico de L.ivanovii y que es requerido para la virulencia completa en el modelo murino. Por tanto, smcL forma parte de un nuevo cluster de virulencia en Listeria que es especifico de especie y que podría jugar un papel importante en el tropismo patogénico de L.ivanovii hacia los rumiantes. Una evidencia de que SmcL podría intervenir en la adaptación hacia los rumiantes es la selectividad lítica que manifiesta hacia los eritrocitos de esto animales, que de entre todos los mamíferos son los que contienen una mayor proporción de esfingomielina en sus membranas. Otra evidencia la proporción de esfingomielina en sus membranas. Otra evidencia la proporción experimentos de infección en la línea celular canina MDCK. En estas celulas, procedentes de una especie no susceptible a la infección por L.ivanovii, y a diferencia de lo que ocurre con celulas bovinas MDBK, la expresión de smcL no promueve la proliferación intracelular del mutante de L.monocytogenes. Además de su papel mecánico en la disrupcion del fagosoma, SmcL interfiere en la via de señalización mediada por la ceramida. Los resultados obtenidos con mutantes isogénicos de L.ivanovii y mediante complementación de un mutane AplcAB de L.monocytogenes demuestran que SmcL, a través de su actividad esfingomielinasa, da lugar a la generación de ceramida a partir de la esfingomielina presente en la membrana de la célula hospedadora. Estos análisis revelaron igualmente que la generación de ceramida requiere la previa disrupcion del fagosoma y el escape de las bacterias hacia el citoplasma, sugiriendo que la actividad de SmcL requiere un pH neutro. En consonancia con esta observacion, mediante comparacion de secuencias hemos podido determinar que SmcL es un homologo estructural de las esfingomielinasas neutras eucariotas. Estas homologias estructurales se correlacionaron a nivel funcional con la demostración de que SmcL tiene un pH optimo de 7,4 y que, al igual que las esfingomielinasas neutras eucariotas, su actividad es dependiente de Mg2+. Por tanto, SmcL podría mimetizar, durante la infeccion intracelular, la función natural de las esfingomielinasas neutras eucariotas, modulando la respuesta de la célula parasitada a través de la interferencia con la via de señalización mediada por la ceramida. Uno de las respuestas celulares controladas por la ceramida es la apoptosis. L.ivanovii produce una intensa reaccion apoptotica en celulas bovinas MDBK y nuestros resultados en experimentos de infección con el mutante isogenico de L.ivanovii afectados en smcL y con el mutante AplcAB de L.monocytogenes complementando con smcL demuestran que la esfingomielinasa de Listeria induce apoptosis durante la infección intracelular. En conclusión, SmcL es un nuevo factor de virulencia de Listeria con un efecto múltiple sobre la patogenesis: facilita por un lado el escape del fagosoma, por otro subvierte la respuesta celular durante la infección, y finalmente juega presumiblemente un papel en el tropismo patogénico hacia los rumiantes
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